流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry, FCM）是一種在功能水平上對液流中排成單列的動物、植物等細(xì)胞或其它生物微粒（如微球、細(xì)菌、病毒等）逐個進(jìn)行多參數(shù)定量分析和分選的檢測手段。該技術(shù)可以高速分析上萬個細(xì)胞，并能同時從一個細(xì)胞中測得多個參數(shù)，具有速度快、精度高、準(zhǔn)確性好、方法靈活等優(yōu)點。流式細(xì)胞術(shù)不僅能夠測量細(xì)胞的大小、內(nèi)部顆粒的性狀，還能檢測細(xì)胞表面和胞漿抗原、細(xì)胞內(nèi)DNA及RNA的含量。此外，流式細(xì)胞術(shù)能夠從單細(xì)胞水平同時分析細(xì)胞樣本中的基因表達(dá)和蛋白表達(dá)，還可以檢測細(xì)胞活性、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖和細(xì)胞氧化等細(xì)胞功能。該技術(shù)不僅能獲得在單個細(xì)胞水平上具有統(tǒng)計學(xué)意義的海量數(shù)據(jù)，還可以更加深入地了解異質(zhì)性細(xì)胞群的詳細(xì)信息。隨著流式細(xì)胞術(shù)水平的不斷提升，其應(yīng)用范圍也日益廣泛，目前已普遍應(yīng)用于免疫學(xué)、干細(xì)胞學(xué)、血液學(xué)、腫瘤學(xué)、藥物學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)等基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域。

流式細(xì)胞儀的液流系統(tǒng)由流動室、樣品管、鞘液管和噴嘴組成。樣品在進(jìn)入流動室之前，其中的細(xì)胞或微粒都是以隨機(jī)的方式進(jìn)行移動。在進(jìn)入流動室之后，樣品在液流壓力的作用下從樣品管中噴出，同時鞘液在高壓下由鞘液管噴出，包裹在樣品流四周，形成穩(wěn)定的同軸流動狀態(tài)，并使其聚焦為窄流，從而將細(xì)胞分離成單細(xì)胞列，然后從噴嘴高速噴出，形成細(xì)胞液柱。樣品流中的細(xì)胞或微粒在鞘液的作用下，會以相同的速度逐一通過激光檢測點。

光學(xué)系統(tǒng)由激發(fā)光源、分光鏡、濾光片以及產(chǎn)生光電流的檢測系統(tǒng)組成。樣品通過激光時，儀器會記錄各單個細(xì)胞的前向散射光（FSC）和側(cè)向散射光（SSC）。FSC主要用于檢測細(xì)胞的相對大小，細(xì)胞越大，產(chǎn)生的FSC就越強(qiáng)。SSC則用于評估細(xì)胞的內(nèi)部復(fù)雜性，細(xì)胞內(nèi)的顆粒成分和精細(xì)結(jié)構(gòu)越復(fù)雜，產(chǎn)生的SSC就更強(qiáng)。經(jīng)熒光染色的細(xì)胞受到合適的光激發(fā)后會產(chǎn)生許多不同波長的熒光信號，分光鏡和濾光片可以將入射的激光束按照特定的角度和波長進(jìn)行分散和反射，使不同波長的光聚焦于不同的位置上。之后光信號通過光電倍增管（Photomultiplier tube, PMT）轉(zhuǎn)化為電信號，傳輸?shù)綌?shù)據(jù)處理系統(tǒng)。

對照設(shè)置

首先，我們需要了解非特異性信號產(chǎn)生的原因：比如常見的腫瘤細(xì)胞自發(fā)熒光，會造成背景信號干擾；又如在單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和B細(xì)胞上，Fc受體均呈現(xiàn)高表達(dá)，在染色過程中抗體Fc端與細(xì)胞表面Fc受體的結(jié)合以及抗體與細(xì)胞的物理結(jié)合與粘附等，也會造成非特異性染色的發(fā)生；樣本中的死細(xì)胞不僅具有更強(qiáng)的自發(fā)熒光，而且更容易產(chǎn)生非特異性結(jié)合，造成假陽性；除此以外，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、病毒感染、藥物處理、體外共培養(yǎng)等也可能會引入熒光信號，對流式檢測結(jié)果造成一定干擾。

為了避免上述情況，在流式染色前需要使用Fc受體阻斷劑對Fc受體造成的非特異性染色加以去除。除此之外，還需要根據(jù)實驗具體情況設(shè)置以下幾種對照來排除非特異性信號。

單染對照

由于熒光染料發(fā)射光不是一個單一的波長，而是覆蓋一定范圍，所以會有熒光滲漏到鄰近波長的檢測器，在進(jìn)行多色流式實驗時，檢測的顏色越多，越容易發(fā)生熒光滲漏。校正溢漏的過程被稱為補(bǔ)償，補(bǔ)償可確保檢測器只計算該通道特定的熒光發(fā)射光。單染對照是只添加一種熒光抗體的樣本，可以顯示出不同熒光基團(tuán)之間光譜重疊的水平，并據(jù)此去除或補(bǔ)償它們之間的重疊。熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)設(shè)定好后，陽性細(xì)胞群應(yīng)位于“目標(biāo)通道陽性、其他通道陰性"的右下象限，陰性細(xì)胞群位于左下象限，兩群體應(yīng)垂直或平行于橫縱坐標(biāo)軸，左上象限不應(yīng)有明顯信號。同時，單染對照還可以輔助調(diào)節(jié)通道電壓，把陽性峰調(diào)節(jié)到合適的位置，防止信號超出接收范圍。

1.單染對照細(xì)胞樣本，因為電壓和背景更接近實際樣本，無合適細(xì)胞樣本時，可用微球代替。

2.同一通道內(nèi)的熒光染料具有不同的發(fā)射光譜，因此單染樣本的熒光染料必須與實驗樣本中的保持一致，例如GFP和FITC這兩種熒光染料是不能相互替換的，因為兩者的發(fā)射光譜不一致。

3.實驗中有幾種不同的熒光染料，就需要設(shè)置幾個單染對照組，一個也不能少。

4.由于復(fù)合染料的差異，單染對照的復(fù)合染料標(biāo)記抗體應(yīng)當(dāng)與實驗所用的抗體相同（來自同一支抗體）。使用相同的復(fù)合熒光染料偶聯(lián)不同的抗體，甚至僅是不同批次抗體，都可能會導(dǎo)致計算結(jié)果不準(zhǔn)確。

5.單染對照的染色結(jié)果必須與實驗樣本亮度相同或更高，以模擬實驗中的任何熒光溢漏情況。

6.對于任何對照，陰性和陽性群體的自發(fā)熒光必須相同。做法是單獨為每個通道的陽性和陰性群設(shè)門，避免使用通用的陰性對照。

7.單染對照的染色結(jié)果，必須要陰陽分群明顯。全陰性，全陽性或者陰陽分群不明顯的樣本都不可作為單染對照。

8.補(bǔ)償依賴于熒光強(qiáng)度中位值的準(zhǔn)確計算，軟件能對熒光的溢出進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)顯著性確定，如果事件太少，將無法準(zhǔn)確計算，因此事件收集數(shù)量應(yīng)多于5000個。

9.單染對照和實驗樣本的處理要相同，上機(jī)電壓也要保持一致。

10.一些低表達(dá)靶標(biāo)（例如IL-17A、IFN-γ等）的陽性細(xì)胞群非常少，調(diào)節(jié)補(bǔ)償時，軟件不能正確識別甚至識別不出，此時可以選擇該樣本高表達(dá)的一些靶標(biāo)（例如CD3、CD4等），用相同的熒光標(biāo)記來代替低表達(dá)靶標(biāo)。

11.補(bǔ)償值一般不會超過100%，如果出現(xiàn)超過100%的情況，可能是串聯(lián)染料斷裂導(dǎo)致。另外，補(bǔ)償值不會出現(xiàn)負(fù)值，如果出現(xiàn)，則表示某些通道存在過補(bǔ)償。

12.軟件自動調(diào)節(jié)完補(bǔ)償，可以打開補(bǔ)償面板，觀察一下每個通道的補(bǔ)償是否合理。若不合理，可以適當(dāng)進(jìn)行微調(diào)。

13.為了更合理地圈出陰陽群，我們可以先根據(jù)FSC和SSC，圈出對應(yīng)細(xì)胞群，這樣更有利于調(diào)節(jié)補(bǔ)償。